簡(jiǎn)述大鼠肝微粒體的制備方法

　　肝臟是藥物的主要代謝器官，富含參與藥物的一相代謝和二相代謝的混合功能氧化酶系統(tǒng)，其中90%藥物主要是由細(xì)胞色素P450酶參與進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。采用從肝臟或腸提取的微粒體，加入還原型輔酶Ⅱ（NADPH）再生系統(tǒng)，在體外模擬生理環(huán)境下進(jìn)行代謝反應(yīng)，采用高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法等測(cè)定方法對(duì)原性藥及代謝產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)定，其中肝微粒體法較為常見(jiàn)。

 

　　大鼠肝微粒體是肝、腸、腎等器官經(jīng)過(guò)差速離心制備的亞細(xì)胞成分，是細(xì)胞器內(nèi)質(zhì)網(wǎng)一部分，該部分表達(dá)有種類多樣的蛋白質(zhì)。具有完整的I相代謝酶（如細(xì)胞色素P450、黃素單加氧酶、單胺氧化酶等），II相代謝酶（如葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶，硫酸基轉(zhuǎn)移酶）、酯酶等，能體現(xiàn)絕大部分人體內(nèi)藥物代謝的情況，是FDA指導(dǎo)原則的預(yù)測(cè)人體內(nèi)代謝及抑制試驗(yàn)的研究工具。

 

　　下面小編要與大家分享的是大鼠肝微粒體的制備方法：

 

　　1、購(gòu)買實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠，20只，雌雄各半，體重（180-220）g。

 

　　2、大鼠肝臟灌流，購(gòu)買的大鼠當(dāng)天腹腔注射3%（30mg?kg-1），使其麻醉，利用酒精進(jìn)行常規(guī)消毒后，打開(kāi)腹腔暴露肝臟，肝門靜脈處進(jìn)行插管并固定。結(jié)扎上腔靜脈，剪破下腔靜脈用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行灌流，直至肝臟顏色呈土黃色。

 

　　3、灌流好的肝臟取出后按1：4比例放入裝有磷酸鹽緩沖液（含1mMEDTA,0.25M蔗糖）的勻漿管內(nèi)，剪碎、勻漿。

 

　　4、將勻漿液倒入50mL高速離心管中在4℃條件下9000g離心20min。

 

　　5、保留上清并轉(zhuǎn)移到超速離心管中，在4℃條件下100000g離心60min。

 

　　6、保留沉淀并重新混懸于磷酸鹽緩沖液（含0.9%的NaCL）中,4℃條件下100000g再離心60min，得到的沉淀即為肝微粒體。

 

　　7、將其重懸于0.1M磷酸緩沖液（PH7.4，20%甘油，1mMEDTA，0.25M蔗糖）中于-70℃冰箱保存，其中留取一小管用于蛋白濃度測(cè)定。